Trong Assassin’s Creed 2, người chơi sẽ tạm rời câu chuyện liên quan tới món cổ vật bí ẩn nằm ở Jerusalem vào thế kỉ 12 và sát thủ Altair quen thuộc. Tuy nhiên, thời gian dài sử dụng cỗ máy Animus để trở lại thời trung cổ đã mang lại cho Desmond một khả năng mới, khi anh có thể thừa hưởng cả tính cách lẫn kĩ năng của tổ tiên. Bằng cỗ máy Animus 2.0 do hội sát thủ phục chế từ bản gốc của tập đoàn Abstergo, công nghệ gen lại mang trí nhớ của anh chàng Desmond Miles đến với Florence, nước Ý thời Phục hưng, nơi mà Ezio - một vị tổ tiên khác của Desmond đang sinh sống.
Cuộc sống của gia đình chàng thanh niên Ezio có vẻ bình thường như bao gia đình quý tộc khác trong thành phố, nhưng mọi thứ bỗng nhiên đảo lộn. Khi ba thành viên trong gia đình bị bắt và treo cổ bởi một vụ vu oan và sự phản bội của Uberto Alberti – một người bạn của gia đình, Ezio đã quyết định trả thù. Sau vụ ám sát Uberto, Ezio bỏ trốn và gặp được người chú của mình là Mario, người hé lộ cho Ezio biết về dòng dõi sát thủ của gia đình mình. Từ đây, cuộc đời Ezio bước sang một con đường mới đầy phiêu lưu và gian khổ.
Assassin’s Creed 2 đánh dấu sự thay đổi trở thành một game hành động trong thế giới mở của dòng game. Bối cảnh chính của trò chơi là Tuscan, Venice và Florence. Người chơi sẽ gặp lại hệ thống di chuyển Free run quen thuộc từ phiên bản đầu tiên, với một chỉnh sửa nhỏ làm tăng tốc độ di chuyển và từ đó mang lại sự phấn khích trong những pha chạy nhảy của mình. Mỗi công trình trong thành phố đều được thiết kế tỉ mỉ nhằm mang lại sự tự do khi di chuyển: bạn có thể leo lên bất kì công trình nào dù cao hay thấp, chỉ cần có chỗ bám tay. Đây là một phần rất quan trọng trong cách chơi của game, bởi nó giúp Ezio thoát thân dễ dàng hơn mỗi khi bị phát hiện và săn đuổi, cũng như bí mật áp sát mục tiêu. Đồng thời cùng với con diều của nhà phát minh trẻ tuổi Leonardo Da Vinci, người chơi có thể bay trên không đồng thời thực hiện một số động tác chiến đấu đơn giảnYếu tố hành động lén lút của Assassin Creed 2 được nâng cấp rất nhiều so với phiên bản đầu tiên. Giờ đây bạn có thể trà trộn vào bất kì nhóm người nào để thoát khỏi tầm mắt của lính canh thay vì chỉ một vài loại đặc biệt như trước. Trong những khu vực có nước chẳng hạn như ở Venice thì lặn xuống nước cũng là một lựa chọn không tồi. Một hệ thống "tai tiếng" (notoriety) được đưa vào game làm gia tăng tính hiện thực và độ thử thách cho người chơi, khi mà Ezio trong lốt ngụy trang có thể bị nhận ra dễ dàng nếu thường xuyên thực hiện những hành động đáng ngờ hoặc bị phát hiện nhiều lần trong những nhiệm vụ trước. Người chơi có thể làm giảm chỉ số này bằng cách mua chuộc, gỡ bỏ hình truy nã hoặc ám sát những tên chỉ huy, tuy nhiên "phòng bệnh hơn chữa bệnh" – cách tốt nhất để thoát khỏi "tai tiếng" vẫn là cẩn thận trong mọi hành vi của mình
Là một game về sát thủ, mọi hành động của người chơi đều nhằm vào một mục đích duy nhất: hạ sát mục tiêu của mình. Người chơi có thể dùng con dao quen thuộc ẩn trong ống tay áo hoặc sử dụng các loại vũ khí của kẻ thù. Các động tác cận chiến được sử dụng tính năng bắt chuyển động (Motion Capture) từ người thật nên khá mượt và đẹp mắt. Tuy nhiên, AI của bọn lính canh trong các pha chiến đấu lại khá kém, khác hẳn với tính cảnh giác vốn gây nhiều khó khăn cho người chơi trong quá trình tiếp cận mục tiêu. Các pha chiến đấu trên diều lượn cũng rất mới lạ và hấp dẫn tuy nhiên lại không có nhiều "đất diễn". Những pha "cảm giác mạnh" bằng cách nhảy từ các tòa nhà cao xuống các đống rơm bên dưới vẫn được giữ lại như một đặc trưng của game, giúp người chơi trải nghiệm cảm giác rơi tự do một cách an toàn.
Game còn nhiều chỉnh sửa khác góp phần tăng thêm sự thú vị của trò chơi. Eagle Vision – tính năng giúp nhận diện các mục tiêu quan trọng – giờ đây được chuyển sang sử dụng ở góc nhìn người thứ ba. Hệ thống ngày đêm được bổ sung mang lại cho người chơi cảm giác mới mẻ, nhất là trong những nhiệm vụ về đêm đòi hỏi phải hành động thật sự yên lặng. Các nhiệm vụ cũng trở nên phong phú hơn về chủng loại, và đôi khi thay đổi "chóng mặt" khiến người chơi bất ngờ. Với khoảng 200 nhiệm vụ khác nhau mà một nửa trong số đó liên quan đến cốt truyện chính của game, Assassin’s Creed 2 sẽ không khiến người chơi nhàm chán bởi sự lặp lại của các nhiệm vụ này
Nền đồ họa của game là cả một bước tiến dài so với phiên bản đầu tiên. Những cử động của Ezio rất mượt mà và ít khi gây nên lỗi xuyên vật thể hoặc kẹt vào lỗi của địa hình. Từng thành phố đều mang lại cảm giác như đang sống trong thời Phục Hưng, với những tháp chuông, đường phố lẫn trang phục của người dân đều được thiết kế tỉ mỉ và chân thực. Chỉ một điều đáng phàn nàn trong mảng đồ họa là hiệu ứng sóng nước khi Ezio lướt thuyền gondola trên những dòng kênh của Venice gần như … không có. Âm nhạc của game được soạn bởi Jesper Kyd, một nhà soạn nhạc nổi tiếng qua hơn 30 game, trong đó có cả dòng game Hitman và gần đây nhất là Borderlands
Cuộc sống của gia đình chàng thanh niên Ezio có vẻ bình thường như bao gia đình quý tộc khác trong thành phố, nhưng mọi thứ bỗng nhiên đảo lộn. Khi ba thành viên trong gia đình bị bắt và treo cổ bởi một vụ vu oan và sự phản bội của Uberto Alberti – một người bạn của gia đình, Ezio đã quyết định trả thù. Sau vụ ám sát Uberto, Ezio bỏ trốn và gặp được người chú của mình là Mario, người hé lộ cho Ezio biết về dòng dõi sát thủ của gia đình mình. Từ đây, cuộc đời Ezio bước sang một con đường mới đầy phiêu lưu và gian khổ.
Assassin’s Creed 2 đánh dấu sự thay đổi trở thành một game hành động trong thế giới mở của dòng game. Bối cảnh chính của trò chơi là Tuscan, Venice và Florence. Người chơi sẽ gặp lại hệ thống di chuyển Free run quen thuộc từ phiên bản đầu tiên, với một chỉnh sửa nhỏ làm tăng tốc độ di chuyển và từ đó mang lại sự phấn khích trong những pha chạy nhảy của mình. Mỗi công trình trong thành phố đều được thiết kế tỉ mỉ nhằm mang lại sự tự do khi di chuyển: bạn có thể leo lên bất kì công trình nào dù cao hay thấp, chỉ cần có chỗ bám tay. Đây là một phần rất quan trọng trong cách chơi của game, bởi nó giúp Ezio thoát thân dễ dàng hơn mỗi khi bị phát hiện và săn đuổi, cũng như bí mật áp sát mục tiêu. Đồng thời cùng với con diều của nhà phát minh trẻ tuổi Leonardo Da Vinci, người chơi có thể bay trên không đồng thời thực hiện một số động tác chiến đấu đơn giảnYếu tố hành động lén lút của Assassin Creed 2 được nâng cấp rất nhiều so với phiên bản đầu tiên. Giờ đây bạn có thể trà trộn vào bất kì nhóm người nào để thoát khỏi tầm mắt của lính canh thay vì chỉ một vài loại đặc biệt như trước. Trong những khu vực có nước chẳng hạn như ở Venice thì lặn xuống nước cũng là một lựa chọn không tồi. Một hệ thống "tai tiếng" (notoriety) được đưa vào game làm gia tăng tính hiện thực và độ thử thách cho người chơi, khi mà Ezio trong lốt ngụy trang có thể bị nhận ra dễ dàng nếu thường xuyên thực hiện những hành động đáng ngờ hoặc bị phát hiện nhiều lần trong những nhiệm vụ trước. Người chơi có thể làm giảm chỉ số này bằng cách mua chuộc, gỡ bỏ hình truy nã hoặc ám sát những tên chỉ huy, tuy nhiên "phòng bệnh hơn chữa bệnh" – cách tốt nhất để thoát khỏi "tai tiếng" vẫn là cẩn thận trong mọi hành vi của mình
Là một game về sát thủ, mọi hành động của người chơi đều nhằm vào một mục đích duy nhất: hạ sát mục tiêu của mình. Người chơi có thể dùng con dao quen thuộc ẩn trong ống tay áo hoặc sử dụng các loại vũ khí của kẻ thù. Các động tác cận chiến được sử dụng tính năng bắt chuyển động (Motion Capture) từ người thật nên khá mượt và đẹp mắt. Tuy nhiên, AI của bọn lính canh trong các pha chiến đấu lại khá kém, khác hẳn với tính cảnh giác vốn gây nhiều khó khăn cho người chơi trong quá trình tiếp cận mục tiêu. Các pha chiến đấu trên diều lượn cũng rất mới lạ và hấp dẫn tuy nhiên lại không có nhiều "đất diễn". Những pha "cảm giác mạnh" bằng cách nhảy từ các tòa nhà cao xuống các đống rơm bên dưới vẫn được giữ lại như một đặc trưng của game, giúp người chơi trải nghiệm cảm giác rơi tự do một cách an toàn.
Game còn nhiều chỉnh sửa khác góp phần tăng thêm sự thú vị của trò chơi. Eagle Vision – tính năng giúp nhận diện các mục tiêu quan trọng – giờ đây được chuyển sang sử dụng ở góc nhìn người thứ ba. Hệ thống ngày đêm được bổ sung mang lại cho người chơi cảm giác mới mẻ, nhất là trong những nhiệm vụ về đêm đòi hỏi phải hành động thật sự yên lặng. Các nhiệm vụ cũng trở nên phong phú hơn về chủng loại, và đôi khi thay đổi "chóng mặt" khiến người chơi bất ngờ. Với khoảng 200 nhiệm vụ khác nhau mà một nửa trong số đó liên quan đến cốt truyện chính của game, Assassin’s Creed 2 sẽ không khiến người chơi nhàm chán bởi sự lặp lại của các nhiệm vụ này
Nền đồ họa của game là cả một bước tiến dài so với phiên bản đầu tiên. Những cử động của Ezio rất mượt mà và ít khi gây nên lỗi xuyên vật thể hoặc kẹt vào lỗi của địa hình. Từng thành phố đều mang lại cảm giác như đang sống trong thời Phục Hưng, với những tháp chuông, đường phố lẫn trang phục của người dân đều được thiết kế tỉ mỉ và chân thực. Chỉ một điều đáng phàn nàn trong mảng đồ họa là hiệu ứng sóng nước khi Ezio lướt thuyền gondola trên những dòng kênh của Venice gần như … không có. Âm nhạc của game được soạn bởi Jesper Kyd, một nhà soạn nhạc nổi tiếng qua hơn 30 game, trong đó có cả dòng game Hitman và gần đây nhất là Borderlands